鸭疫里默氏杆菌疫苗相关研究汇总 中国标准物质信息网--邱媛媛 我国是养鸭生产及消费大国，随着规模化养鸭场不断兴起，养鸭场的饲养密度不断增加的同时，导致疫病不断流行。鸭疫里默氏杆菌病是严重危害养鸭业的一种细菌性传染病，发病率和死亡率居高不下，造成极大的经济损失。目前，养殖过程中主要采用抗生素防治细菌病，但由于抗生素的不合理使用，导致了广泛的耐药性，另外药物残留直接影响动物产品的安全，严重威胁畜牧业生产和到人类健康。鸭疫里默氏杆菌疫病防控技术研究与应用集成了检测技术及疫苗防控技术，能够有效防控鸭疫里默氏杆菌疫病，并减少抗生素的使用，使人们能够吃上放心的鸭类产品。 鸭疫里默氏杆菌病又称鸭传染性浆膜炎，是由鸭疫里默氏杆菌(Riemrella anatipestifer ，RA)引起的一种主要侵害雏鸭、雏火鸡、鹅等多种禽类的急性或慢性、败血性、接触性传染病。该病以10 日龄～35 日龄的雏鸭发病较多，发病率最高可达90 %以上，死亡率为5 %～75 %，是影响养鸭业的重大传染病之一。该病的控制主要依靠抗生素治疗，但由于该菌对多种抗生素耐药性不断增加和食品安全的需要，所以疫苗研制十分迫切。 RA 血清型众多，目前世界范围内已确定的有21 种，各血清型之间的交叉保护作用差。
来自中国农业科学院上海兽医研究所的研究者于圣青长期从事鸭疫里默氏杆菌分子致病机制研究及布氏杆菌侵染与胞内寄生相关的分子机制研究。他们对全国各地分离到数百株RA 分离株的血清学研究结果表明流行菌株的优势血清型是血清1、2 和10 型。随后他们对10 株血清1 型RA 分离株的毒力和免疫保护性进行测定，并研制灭活油乳剂疫苗，为RA 多价灭活油乳剂疫苗的研制提供基础。
在一篇研究论文中（血清 1 型鸭疫里默氏杆菌灭活油乳剂疫苗的研制，doi： 10.3969/j.issn.1008-0589.2012.04.15），研究者将10 株血清1 型RA 临床分离株经动物体复壮后回收、鉴定得到实验菌株。对上述菌株进行毒力测定的结果表明，所有被测血清1 型RA 分离株均具有较强的致病力，能够100 %致死7 日龄健康雏鸭。采用以上方法制备的血清1 型RA 灭活油乳剂疫苗，其安全性、稳定性均符合细菌灭活苗标准，并且疫苗生产操作方法易于推广，便于临床应用。同时，该研究对血清1 型RA 油乳剂灭活苗的制苗用菌株进行了筛选，发现运用分离株CH3、CQ3、YXb12 制备的油乳剂灭活苗其诱导的抗体水平高，并具有很好的免疫保护率，对高剂量强毒也具有较好的保护效果。血清1 型RA 制苗用菌株的选定为制备多价油乳剂灭活苗提供基础。
在另外一篇研究报告中（血清2型鸭疫里默氏杆菌制苗用菌株的筛选及灭活油乳剂疫苗的研制），研究人员将血清2 型RA 临床分离株进行动物体内复壮，经分离、鉴定得到实验菌株。细菌复壮结果表明血清2 型RA 都具有较强的致病力，7 日龄健康雏鸭感染RA 后3天内全部死亡。研究者采用一系列方法制备的血清2 型RA 油乳剂灭活苗免疫鸭后，不仅能诱导产生较高水平的血清抗体，而且对血清2 型RA 强毒攻击具有很好的保护力。此外，比较血清2 型RA 不同菌株疫苗的免疫保护率可以发现：各个菌株的免疫原性存在一定差异，该研究制备的血清2 型RA 油乳剂灭活疫苗，免疫鸭后不产生任何病理性变化，其安全性、稳定性均符合细菌灭活苗标准，且疫苗生产操作方法易于推广，便于临床应用。本研究在流行病学调查的基础上研制出RA 优势血清型血清2 型RA 灭活油乳剂疫苗，希望能为鸭传染性浆膜炎的防控做出贡献。
在第三篇研究论文中（血清10型鸭疫里默氏杆菌灭活油乳剂疫苗的研制），研究者将10 株血清10 型RA进行易感动物体内复壮，经细菌分离、生化和特异PCR鉴定得到试验菌株。研究表明所有被测的血清10 型RA分离株对雏鸭均具有较强的致病性。选取其中2 株进行毒力测定，实验结果表明，相同血清型的不同菌株间的毒力差异很大，研究者在试验制备的血清10 型RA 灭活油乳剂疫苗，对5 日龄和18 日龄樱桃谷鸭进行2 次免疫后，可产生良好的免疫应答。与致病力相似，各分离株之间的免疫原性也存在差异，YXb11 免疫组虽然能诱导机体产生一定水平的血清抗体，但对血清10 型RA强毒的保护率较低；比较而言，运用HXb2 制备的灭活油乳剂疫苗不仅能诱导产生较高的抗体水平，并具有很好的免疫保护率，是较理想的制苗用菌株。因此血清10 型RA灭活油乳剂疫苗的研制为多价灭活油乳剂疫苗的制备奠定了基础。
2011年在国际杂志AVlAN DISEASES上发表的论文中（Development of Loop-Mediated Isothermal Amplification (LAMP) Targeting the GroEL Gene for Rapid Detection of Riemerella anatipestifer），研究人员通过开发出了一种靶向作用GroEL基因的环介导等温扩增技术(loop-mediated isothermal amplification)用于鸭疫里默氏杆菌的快速检测。
环介导等温扩增技术(loop-mediated isothermal amplification，LAMP)是一种简单、高效快速的进行基因组DNA检测的特殊检测技术，该技术可以对多种病原体进行检测，比如流感病毒A型、大肠杆菌、结核分枝杆菌；这种新型技术并不需要复杂的循环步骤，20分钟的反应时间就足以对靶向DNA进行扩增以达到可检测的水平，相比较PCR技术而言，LAMP技术具有反应简单性和敏感性等特性。
近来有科学家们利用四组引物开发出了靶向作用ompA基因的环介导等温扩增技术，本文研究中，研究人员就设计出了靶向细菌GroEL基因的6组引物，并且利用这种新型体系开发出了一种新型检测鸭疫里默氏杆菌的LAMP技术，这种新型技术就可以通过对感染细菌的鸭子肝脏样本及细菌培养液进行目标菌株的检测，此前研究人员研究发现，GroEL基因在不同血清型的细菌中具有高度保守性，基于此本文中研究人员选择GroEL基因作为靶点来开发检测鸭疫里默氏杆菌的新型LAMP技术。
同年，刊登在Journal of Microbiological Methods上的一项研究论文中（doi：10.1016/j.mimet.2011.07.007），研究人员开发出新型的多重PCR技术用于同时检测鸭子机体中的鸭疫里默氏杆菌、大肠杆菌及肠炎沙门菌。
鸭疫里默氏杆菌、大肠杆菌及肠炎沙门菌三种细菌非常常见且容易引发临床疾病，截至目前为止，科学家们并没有开发出可同时检测出这三种致病菌的分子学方法，此前有报告显示种特异性的多重PCR（m-PCR）可以作为一种快速的工具来对致病菌进行鉴别并且有效区分，而且多重PCR技术还适合对大量样本进行检测。
本文研究中，研究人员就开发出了同时检测上述三种细菌的新型多重PCR技术，整个检测过程可以在4小时内完成，相比常规的细菌分离和鉴定（至少24-48小时）而言，检测时间大大缩短了。研究者利用鸭疫里默氏杆菌的dnaB基因、大肠杆菌的PhaA基因及肠炎沙门菌的invA基因作为靶向基因来设计特殊引物。
研究人员首次利用鸭疫里默氏杆菌的dnaB基因作为检测的靶向基因，序列分析结果表明，在各血清型的鸭疫里默氏杆菌中dnaB基因具有98.1%-100%的相似性。选择PhaA基因进行大肠杆菌的检测原因有1）肝脏和大脑中发现的大肠杆菌和病原性感染存在直接关联；2）致病性大肠杆菌中毒力因子在不同菌株中并不相同，当前所有在病变组织中检测的毒力相关因子也都在临床健康的鸡的粪便中检测到了；3）此前有报道利用dnaB基因来作为进行大肠杆菌检测的靶点。在很多研究报道中科学家们都利用invA基因来进行禽类沙门菌的检测，因此本文研究中研究人员就利用该基因作为检测样本中肠炎沙门菌的靶向基因。
本文研究中，研究着开发的这种新型多重PCR技术可以成功检出103CFU的目标菌（三种菌），有证据显示，在很多病例中，多重PCR的灵敏度会随着反应系统中靶向基因数量的增加而降低，本文研究中，研究人员就通过一系列研究，结果表明，新型的多重PCR技术适合对临床和感染性的组织样本中的鸭疫里默氏杆菌、大肠杆菌及肠炎沙门菌三种细菌进行检测，而且该技术对三种致病菌具有一定的特异性，当然还可以对培养基或其它临床样本中的不同细菌进行检测。研究人员希望利用这种新开发的检测技术可以帮助后期对样本中的致病菌进行快速检测，为进行致病菌的流行病学监测提供一定基础和思路。
2013年研究者在国际杂志Clinical and Vaccine Immunology上发表论文（doi：10.1128/CVI.00768-12）揭示了他们如何开发并且评估了新型的三价鸭疫里默氏杆菌灭活疫苗。
鸭疫里默氏杆菌是一种革兰氏阴性、不运动、不产芽孢的杆菌，该菌是严重危害养鸭业的一种细菌性传染病，发病率和死亡率居高不下，造成极大的经济损失。在我国鸭疫里默氏杆菌的主要血清型为1型、2型和10型。
当前利用多种抗生素可以来抑制并且控制鸭子被鸭疫里默氏杆菌感染，但随着抗生素的使用鸭疫里默氏杆菌对抗生素的耐药性越来越强，而且研究人员在鸭类相关产品中也检出了抗生素残留；因此采用免疫接种的方法或许可以有效控制鸭疫里默氏杆菌的感染，而基于单一血清型的疫苗似乎不能在多个血清型之间提供明显的交联保护机制，为此研究者开发了一种三价的福尔马林灭活菌苗，包括鸭疫里默氏杆菌1、2、5和大肠杆菌O78以及鸭疫里默氏杆菌，然而这种菌苗产生的的保护作用在二次接种后仅能维持2周时间，弱毒活疫苗(live attenuated vaccines)可以刺激细胞介导的机体免疫反应及抗体反应，但这并不能解决当前面对的难题。 随后研究者计划尝试开发一种抵御鸭疫里默氏杆菌的新型亚单位疫苗；此前有研究报道，鸭疫里默氏杆菌的外膜蛋白A（OmpA）和41kDa的不完全蛋白是具有免疫原性的蛋白质，然而确定的亚单位疫苗并不能为抵御异源性血清型的菌株感染提供保护作用，随后研究者对细菌的GroEL蛋白进行了重组，就使其在血清型1、2和10中表现出了交联的保护作用，但这种保护作用并不充足；因此研究人员就开发了包含本地流行菌株的有效鸭疫里默氏杆菌疫苗，其就可以提供有效的保护作用。 研究者的目的就是开发出一种三价的鸭疫里默氏杆菌灭活疫苗，并且评估接种疫苗后鸭子体内的保护作用及免疫反应，研究者选用血清型1、2和10的菌株因为这三种血清型是鸭疫里默氏杆菌在中国主要的血清型。
2015年，研究者在国际杂志PLoS ONE上刊登了题为"Development of Colloidal Gold Immunochromatographic Strips for Detection of Riemerella anatipestifer"（DOI：10.1371/journal.pone.0122952）的一项研究论文，文章中研究者开发了一种新型的鸭疫里默氏杆菌胶体金检测试纸条。
实验室目前进行鸭疫里默氏杆菌的检测方法包括血清学方法，比如凝集试验、琼脂凝胶免疫扩散试验(AGID)、酶联免疫吸附试验（ELISA）；凝集试验和琼脂凝胶免疫扩散试验可以对细菌的血清型进行鉴定，而ELISA则利用抗原来检测细菌的抗体；而近年来科学家们开发的新型分子生物学方法包括PCR试验、多重PCR试验以及环介导等温扩增(loop-mediated isothermal amplification)，然而这些方法都比较麻烦，上述这些方法均需要专业技术人员、特殊的设备、试剂，同时还需要花费数小时才能完成，因此开发一种高效、快速、特异性并且容易操作的检测方法就显得非常有必要。
本文中，研究人员就开发了一种新型的胶体金检测试纸条来对鸭疫里默氏杆菌进行检测，这种试纸条是一种新型、快速、一步法的检测性试纸，其利用胶体金作为示踪剂；此前研究者Beggs和Osikowicz首次开发出胶体金试验用以对人体绒膜促性腺激素（Human Chorionic Gonadotropin）进行定性检测，随后这种胶体金检测技术就被广泛用于诊断多种疾病之中，该技术的优点是快速、简单、特异性强，而且具有敏感性。
此外胶体金测试技术还可以用于检测生物活性分子、激素及半抗原；在牲畜的微生物检测方面，胶体金检测试纸条可以被用于检测牛病毒性腹泻及白斑综合征，然而目前并没有研究报道利用胶体金检测试纸条进行鸭疫里默氏杆菌的检测，为此本文中研究人员就利用抵御鸭疫里默氏杆菌GroEL蛋白的单克隆抗体开发出了检测该菌的新型胶体金检测试纸条，就为后期进行禽类鸭疫里默氏杆菌的快速、特异性检测提供了坚实的基础。
同一年研究者在国际杂志Veterinary Microbiology上发表了题为"The M949_1556 gene plays a role on the bacterial antigenicity and pathogenicity of Riemerella anatipestifer"的一项研究论文，文章中研究者解释了M949_1556基因在鸭疫里默氏杆菌的细菌抗原和致病性上扮演的重要角色。
在中国流行的鸭疫里默氏杆菌血清型主要为1、2及10型，2012年有研究者报道说伴侣蛋白GroEL可以为三种不同血清型的鸭疫里默氏杆菌提供交叉保护作用。
此前研究者利用鸭疫里默氏杆菌菌株CH3构建出了随机的Tn4351转座子突变文库，同时鉴别出了33个和细菌生物被膜相关的特殊基因；本文研究中研究人员利用抵御鸭疫里默氏杆菌1型脂多糖的单克隆抗体（anti-LPS MAb）对构建的转座子突变体文库进行筛选，发现了其中一个携带anti-LPS MAb的突变体失去了反应性，随后测序结果表明，该突变菌株中M949_1556基因处于失活状态，研究者以CH3△M949_1556命名该基因，本文研究为后期深入理解CH3△M949_1556菌株的细菌抗原性及致病性提供了一定思路。
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